Velikostně vylučovací chromatografie (SEC) patří k nejpoužívanějším metodám charakterizace biofarmaceutik. Separuje vysokomolekulární formy (HMW), monomer a nízkomolekulární fragmenty (LMW) podle hydrodynamické velikosti. Větší molekuly pronikají do menší části pórů stacionární fáze a eluují se dříve, zatímco menší molekuly vstupují do většího objemu pórů a eluují se později.
Robustní metoda vyžaduje sladění velikosti analytu s distribucí pórů, vhodnou velikost částic a omezení nespecifických interakcí. To je zásadní u protilátek, konjugátů protilátka-léčivo (ADC), oligonukleotidů, mRNA i virových částic. Portfolio Sepax zahrnuje kolony pro UHPLC, HPLC, FPLC i preparativní použití.
Princip SEC chromatografie
Selektivita začíná u velikosti pórů
SEC nerozděluje molekuly přímo podle molární hmotnosti, ale podle hydrodynamické velikosti, kterou ovlivňuje tvar, konformace, solvatace, glykosylace i stav asociace. Rozsah molárních hmotností je proto pouze orientační; optimální fázi určí experimentální screening.
Příliš malé póry mohou vylučovat cílový analyt i jeho agregáty, takže se eluují blízko mrtvého objemu a jejich rozlišení klesá. Příliš velké póry poskytují složkám podobný přístup do porézního objemu a selektivitu rovněž snižují. Pro monoklonální protilátky a jejich rozpustné agregáty je obvyklým výchozím bodem fáze s velikostí pórů okolo 300 Å. Menší proteiny, peptidy a oligonukleotidy často vyžadují 80 - 150 Å, zatímco mRNA a virové částice podstatně širší póry.
Zenix a Zenix-C nabízejí póry 80 - 300 Å. SRT a SRT-C pokrývají přibližně 100 - 2000 Å a rozšiřují screening na velké nukleové kyseliny a virové vektory. Preparativní SRT-10 a SRT-10C umožňují vyšší zatížení.
Velikost částic určuje účinnost a tlak
Menší částice zvyšují účinnost a rozlišení, ale také protitlak a citlivost k mimokolonové disperzi. Unix a Unix-C s částicemi 1,8 µm jsou určeny pro UHPLC, Zenix a Zenix-C s částicemi 3 µm pro HPLC. SRT a SRT-C s částicemi 5 µm představují kompromis mezi účinností a robustností, zatímco SRT-10 a SRT-10C s částicemi 10 µm jsou vhodné i pro preparativní aplikace.
U kolon o průměru 4,6 mm s částicemi pod 3 µm je nutné minimalizovat mimokolonový objem krátkými kapilárami, malou detekční celou a nízkým nástřikem. Při převodu z kolony 7,8 mm nelze bez přepočtu zachovat průtok ani injekční objem.
Obrázek: SEC analýza agregátů bispecifických protilátek na kolonách Sepax SRT-C 300 Å a Zenix-C 300 Å (7,8 × 300 mm) při průtoku 1,0 ml/min. Kolona Zenix-C s částicemi 3 µm poskytla vyšší účinnost separace. Mobilní fáze: 50 mM fosfátový pufr, 250 mM KCl, pH 7,0; detekce při 280 nm.
Chemie povrchu omezuje sekundární interakce
Ideální SEC je neadsorpční, biomolekuly však mohou interagovat s reziduálními silanolovými skupinami, vázanou fází, kovovými povrchy systému nebo hydrofobními oblastmi náplně. Důsledkem bývá opožděná retence, chvostování píků, nižší výtěžnost nebo zkreslený obsah agregátů. Riziko je vyšší u bazických a hydrofobních proteinů, ADC a PEGylovaných produktů.
Fáze Sepax využívají hydrofilní vázané vrstvy omezující kontakt analytu se silikagelem. Standardní řady Unix, Zenix, SRT a SRT-10 jsou vhodné pro běžné proteiny. Varianty „-C“ jsou určeny pro analyty náchylné k hydrofobním a dalším nespecifickým interakcím, například ADC, derivatizované protilátky nebo PEGylované a fúzní proteiny.
BioMix kombinuje velikostní separaci s řízeným příspěvkem hydrofobních interakcí. Může tak rozlišit biomolekuly podobné velikosti, ale rozdílné povrchové hydrofobity, například správně a chybně spárované bispecifické protilátky.
Obrázek: Analýza správně a chybně spárovaných forem bispecifické protilátky na kolonách Sepax BioMix SEC 300 Å a Zenix-C SEC 300 Å (7,8 × 300 mm). BioMix poskytla vyšší selektivitu pro chybně spárované formy, zatímco Zenix-C minimalizovala nespecifické interakce.
Praktický výběr kolony
Nejprve je třeba definovat cíl metody: kvantifikaci agregátů, rozlišení fragmentů, popis distribuce velikostí nebo preparativní sběr. Následuje screening dvou až tří velikostí pórů, volba částic a průměru kolony podle tlakového limitu, množství vzorku a požadované propustnosti a porovnání standardní chemie s variantou „-C“.
Výchozí mobilní fází bývá neutrální fosfátový pufr s dostatečnou iontovou silou pro potlačení elektrostatických interakcí. Podle chování analytu lze upravit koncentraci soli, pH, typ pufru nebo přidat malé množství organického modifikátoru. Změny však mohou ovlivnit konformaci a stav asociace proteinu, a tím i zdánlivý obsah agregátů. Injekční objem i hmotnostní zatížení mají zůstat nízké; průtok a teplota se optimalizují až po výběru pórů a povrchové chemie.
SEC lze kombinovat s UV, refraktometrickou detekcí nebo MALS. SEC-MALS s koncentračním detektorem poskytuje molární hmotnost napříč píkem a pomáhá odlišit skutečnou změnu velikosti od anomální retence.
Obrázek: Separace Cas9 mRNA a jejích vysokomolekulárních agregátů na kolonách Sepax SEC a srovnávacích kolonách. Kolony Sepax s částicemi 5 µm a póry 1000 nebo 2000 Å (4,6 × 300 mm) poskytly vysoké rozlišení HMW forem. Mobilní fáze: 50 mM Tris, 200 mM NH₄Cl, pH 7,5; detekce UV při 260 nm a MALS.
Závěr
Spolehlivá SEC metoda vychází z koordinované volby pórů, částic, chemie povrchu, formátu kolony a mobilní fáze. Portfolio Sepax SEC poskytuje ucelený rámec od 1,8µm UHPLC analýzy až po 10µm semi-preparativní a preparativní separace, s velikostmi pórů pokrývajícími malé proteiny a oligonukleotidy až po mRNA a virové částice. Umožňuje tak vyvíjet metody s lepší selektivitou, výtěžností a robustností jak u zavedených biologických léčiv, tak u nastupujících terapeutických modalit.
Autoři: Yinan Zhang Ph.D, Linting Li, Xuyang Zhang a Ke Yang Ph.D, Sepax Technologies, Inc.
Pro další inforamce neváhejte kontaktovat: Irena Palíková, Altium International s.r.o., [email protected]
